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ONPG wird seit vielen Jahren als Substrat der β-Galactosidase verwendet. Die Eigenschaften dieses Enzymes sind detailiert untersucht worden (z.B. Ref. 1 - 3). Expres- sionsplasmide mit der kodierenden Sequenz für β-Galactosidase werden häufig als interne Kontrolle in Transfektionsexperimenten in Expressions- / Transkriptionsstudien eingesetzt, dann meistens unter der Regulation eines starken viralen Enhancers (SV40, CMV, RSV, HIV u.a.). Die Aktivität des Enzyms kann einfach aus den entsprechenden Zellextrakten bestimmt werden (z.B. Ref. 4). Die Spaltung von ONPG durch β-Galactosidase ergibt einen gelben Farbstoff, dessen Intensität bei 405 - 420 nm im Spektralphotometer bestimmt wird. Ein gängiger Puffer ist 60 mM Na₂HPO₄/ 39 mM NaH₂PO₄ pH 7,0 / 10 mM KCl / 1 mM MgSO₄ / 2 mM DTT und 1 mg/ml ONPG. ONPG löst sich nicht besonders gut. Deshalb sollte die Lösung im 37°C-Wasserbad erwärmt und / oder geschüttelt werden. ONPG und DTT werden dem Puffer jeweils frisch zugesetzt (4).Achtung: Es wird für diese Untersuchungen die bakterielle β-Galactosidase (E. coli) verwendet. Das pH-Optimum dieses Enzyms liegt bei pH 7,3. In Säugerzellen gibt es eine lysosomale β-Galactosidase mit einem pH-Optimum bei 3,5. Um keinen Hintergrund endogener β-Galactosidase zu erhalten sollte auf den pH-Wert des Meßpuffers geachtet werden!
Literature
(1) Wallenfels, K. et al. (1960) Biochem. Z. 333, 377-394. Untersuchungen über milchzuckerspaltende Enzyme. (2) Wallenfels, K. (1962) Methods Enzymol. 5, 212-219. β-Galactosidase: Nachweismethode, Reinigung und Kristallisation. (3) Levvy, G.A. & Conchie, J. (1966) Methods Enzymol. 8, 571-584. Glycosidasen der Säuger und ihre Hemmung durch Aldonolactone. (4) Janknecht, R. et al. (1995) Oncogene 10, 1209-1216. Untersuchung eines Transkriptionsfaktors in transienten Transfektionen.
