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Biologische Puffer

Anforderungen an biologische Puffer
Ursprünglich wurden verschiedene anorganische Substanzen als Puffer verwendet (z.B. Phosphat, Cacodylat, Borat, Bicarbonat u.a.), die später durch schwache organische Säuren ergänzt wurden. Viele dieser Puffersubstanzen haben aber den Nachteil, dass sie nicht inert sind und das zu untersuchende System nachhaltig beeinflussen (z.B. Hemmung von Enzymen, Wechselwirkungen mit Enzymsubstraten usw.).
Die meisten der heute verwendeten biologischen Puffer wurden von Norman E. Good und seinen Mitarbeitern entwickelt. Es handelt sich hierbei um N-substituierte Taurin- oder Glycin-Puffer. Diese zwitterionischen Puffer erfüllen die meisten der Kriterien, die ein biologischer Puffer erfüllen muss.

Löslichkeit: Der Puffer soll eine hohe Wasserlöslichkeit und geringe Löslichkeit in anderen Lösungsmitteln besitzen. Je höher die Wasserlöslichkeit ist, desto einfacher ist die Herstellung konzentrierter Stammlösungen.

Permeabilität: Der Puffer sollte nicht durch biologische Membranen permeieren, um eine Konzentrierung innerhalb der Zelle/Organelle zu verhindern. Tris ist relativ gut fettlöslich und kann daher durch Membranen gelangen. Dies erklärt auch seine Toxizität für viele Säugerzellen in Kultur.

Ionenstärke: Der Puffer soll die Ionenstärke des Systems möglichst nicht verändern. Die physiologische Ionenstärke liegt bei 100 - 200 mM KCl oder NaCl. Besonders bei der Untersuchung von enzymatischen Reaktionen kann diese eine große Rolle spielen, denn die Ionenstärke der Lösung ist ein Maß für das Ionen-Milieu, das auch die katalytische Aktivität eines Enzymes beeinflussen kann. Die Protonierung und Deprotonierung in Abhängigkeit von der Ionenzusammensetzung des umgebenden Mediums im Reaktionsansatz beeinflusst die Bindung und Umsetzung eines Enzymsubstrates durch ein Enzym.

Abhängigkeit des pK_a-Wertes: Der pK_a-Wert eines Puffers soll nur so gering wie möglich durch die Pufferkonzentration, die Temperatur und die Ionenzusammensetzung des Mediums beeinflusst werden. Zu den Puffern mit Temperatur-sensitiven pK_a -Werten zählen z.b. die Amin-Puffer, während Carboxylsäure-Puffer generell weniger sensitiv auf Temperatur-Schwankungen reagieren.

Komplex-Bildung: Wenn ein Puffer Komplexe mit Metallionen bildet, werden Protonen freigesetzt, das ein Absinken des pH-wertes zur Folge hat. Das größere Problem ist dabei aber meist die Bildung unlöslicher Präzipitate. Falls Enzyme die Metallionen für ihre Aktivität brauchen, würden sie gehemmt werden. Komplexe sollten also löslich und die Bindungskonstante bekannt sein. Phosphate bilden zum Beispiel unlösliche Salze mit zweiwertigen Metallen und fallen aus. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) wird deshalb nie mit Ca²⁺ und Mg²⁺ autoklaviert. Good-Puffer wie PIPES, TES, HEPES und CAPS besitzen sehr niedrige Metall-Bindungskonstanten und sind daher besonders für die Untersuchung von Metall-abhängigen Enzymen geeignet.

Inerte Substanzen: Der Puffer sollte weder enzymatischen noch nichtenzymatischen Veränderungen unterliegen, d.h. kein Enzymsubstrat/-inhibitor sein oder mit Metaboliten oder anderen Komponenten reagieren. Der Puffer soll also inert sein. Phosphat oder Pyrophosphat sind sowohl Substrate als auch Inhibitoren verschiedener enzymatischer Reaktionen (Hemmung der Carboxypeptidase, Urease, verschiedene Kinasen, verschiedene Dehydrogenasen). Borat bildet kovalente Komplexe mit Mono-/Oligosacchariden, Ribose-Untereinheiten von Nukleinsäuren, Glycerin oder Pyridin-Nukleotiden. Bicarbonat steht mit CO₂ im Gleichgewicht und erfordert deshalb ein geschlossenes System. Tris und andere primäre Amine können Schiff- Basen mit Aldehyden und Ketonen bilden. Außerdem stören sie den Bradford-Proteinnachweis (z.b. Tris und Glycin). Tricin wird durch Flavine photooxidiert, so dass Tageslicht ausreicht um die Aktivität von Flavinenzymen zu reduzieren. HEPES, HEPPS und Bicin stören den Lowry (Folin)-Proteinnachweis. Puffer, die chemisch auf dem Piperazin-Ring basieren, können unter bestimmten Umständen Radikale bilden.

UV-Absorption: Puffer sollen kein Licht der Wellenlängen größer als 230 nm absorbieren, da viele spektrophotometrische Untersuchungen in diesem Bereich erfolgen (Konzentrationsbestimmungen von DNA, RNA und Proteinen). ADA hat zum Beispiel eine Absorption von 0,1 bei 260 nm. Wenn Puffer bei photometrischen Nachweisen stören, sollten sie neutralisiert werden oder auf das pH-Optimum des Testsystems eingestellt werden (Lowry pH 10; BCA pH 11; Bradford pH 1; kolloidales Gold pH 3). Falls das nicht möglich ist, können Proteine z.b. mit Trichloressigsäure, Perchlorsäure oder Aceton gefällt werden und anschließend in einem störungsfreien Lösungsmittel wieder gelöst werden.

Kriterien für die Auswahl
Auswahl des Puffers für den richtigen pH-Bereich
Der pK_a-Wert des Puffers sollte im optimalen pH-Bereich für das Testsystem liegen. Wenn der pH-Wert während des Versuchs ansteigen kann, sollte ein Puffer mit einem pK_a-Wert gewählt werden, der leicht über dem Optimum zu Beginn des Versuchs liegt. Umgekehrt sollte ein Puffer mit einem etwas niedrigeren pK_a-Wert gewählt werden, wenn zu erwarten ist, dass der pH-Wert während des Experiments sinkt.

Bestimmung des pH-Optimums eines Enzyms
Wenn ein Enzym untersucht werden soll, ist der erste Schritt in der Regel die Bestimmung der Bedingungen, unter denen das Enzym ein Höchstmaß an Stabilität und Aktivität aufweist. Zur Bestimmung des pH-Optimums empfiehlt es sich, zunächst Puffer zu verwenden, die ein breites pH-Spektrum abdecken, z.B. MES, PIPES, HEPES, TAPS, CHES und CAPS. Nach Identifizierung des pH-Optimums können andere Puffer (z.B. für den pH-Wert 7,5: TES, TEA oder Phosphat) getestet werden, um unspezifische Pufferwirkungen für spätere Untersuchungen ausschließen oder minimieren zu können. Der pK_a-Wert eines Puffers, d.h. der Mittelpunkt seines pH-Bereichs, sollte so nah wie möglich am gewünschten pH-Wert für den verwendeten Puffer liegen. Mit anderen Worten, der pK_a sollte dem pH-Optimum des zu testenden Enzyms entsprechen. Die protonierten (ionisierten) Formen von Aminpuffern haben weniger hemmende Wirkungen als die nicht-protonierten Formen. Für Tris und zwitterionische Puffer ist daher in der Regel ein Arbeitsbereich etwas niedriger als der pK_a-Wert besser geeignet, während im Gegensatz dazu Carbonsäurepuffer mit einem Arbeitsbereich leicht über ihren pK_a-Werten besser geeignet sind, da diese Puffer hauptsächlich aus der ionisierten Form bestehen.

Bestimmung der optimalen Pufferkonzentration
Eine ausreichende Pufferkapazität wird oft erst bei Konzentrationen über 25 mM erreicht. Höhere Pufferkonzentrationen und damit verbundene hohe Ionenstärken können jedoch die Enzymaktivität hemmen. Geeignete Anfangskonzentrationen liegen daher zwischen 10 und 25 mM. Ändert sich nach Zugabe des Proteins oder Enzyms der pH-Wert um mehr als 0,05 Einheiten, kann zunächst die Konzentration des Puffers auf 50 mM erhöht werden. Bis zu dieser Konzentration wurde bei Zellkulturexperimenten keine Interferenz mit den "Good buffers“ beobachtet. Um Komplexe mit Schwermetallen zu bilden, kann EDTA zugesetzt werden.

Anwendungsabhängige Auswahl der Puffersubstanzen
Die Entscheidung für oder gegen einen Puffer ist auch abhängig von der Methode, für die er verwendet wird. Neben der Aktivitätsmessung wird die Proteinkonzentration in der Regel nach Isolations- oder Reinigungsprozessen bestimmt. Viele der auf Aminosäuren basierenden Puffersubstanzen können bei Protein-Assays (z.B. Lowry) aufgrund von Wechselwirkungen mit den Reagenzien oder der Absorption der Puffersubstanz selbst im Bereich über 230 nm zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Diese Störungen können jedoch durch die Einbindung des Puffers in die Leerwertkontrolle od. Negativkontrolle leicht beseitigt werden.
Viele Puffer sind grundsätzlich für die Gelfiltration geeignet. Kationische Puffer wie Tris werden für die Anionenaustauschchromatographie bevorzugt. Anionische Puffer (wie Phosphat oder MES) sind für die Kationenaustauschchromatographie oder Hydroxylapatit-Chromatographie zu bevorzugen, d.h. der Puffer sollte die gleiche Ladung wie das Ionenaustauschermaterial aufweisen, um zu verhindern, dass es sich selbst an den Ionenaustauscher bindet.
Borat ist nicht für die Isolierung von Glykoproteinen oder Systemen mit Nukleotiden geeignet, da es mit der cis-Hydroxylgruppe von Zuckern interagiert. Wird die Elektrophorese nach der Auflösung des Proteins in Proteinreinigungssystemen durchgeführt, sollte ein Puffer mit geringer Ionenstärke verwendet werden, da eine hohe Ionenstärke das Gel erwärmen würde.
Die "Good buffers“ auf Basis des Piperazinrings - HEPES, HEPPS, HEPPSO und PIPES - sind nicht für die Untersuchung von Redoxprozessen geeignet, da sie in Gegenwart von H₂O₂ Sauerstoffradikale, autooxidierendes Eisen oder unter bestimmten elektrolytischen Bedingungen leicht Radikale bilden. Im Gegensatz dazu bildet der "Good buffer“ auf Basis eines Morpholinrings, MES, keine Radikale.

Hinweise zur Einstellung des pH-wertes eines Puffers
Puffer bestehen aus einer Säure und ihrer konjugierten Base. Die Qualität eines Puffers hängt von seiner Pufferkapazität ab, d.h. der Resistenz gegen Schwankungen des pH-wertes bei Zugabe starker Säuren bzw. Basen. Mit anderen Worten: Die Pufferkapazität entspricht der Menge an H⁺- oder OH^-- Ionen, die durch den Puffer neutralisiert werden können. Die Pufferkapazität steht im Beziehung zur Pufferkonzentration und erreicht ihr Maximum bei dem pKa-Wert. Dieser Punkt entspricht also dem Mittelpunkt des pH-Bereiches, der durch den Puffer abgedeckt wird. Hier ist die Konzentration von Säure und Base gleich. In der Nachbarschaft dieses pH-Bereiches bewirken also relativ große H⁺-/OH^--Mengen nur kleine pH-änderungen. Ein Puffer, dessen pH-Wert eine pH-Einheit über oder unter seinem pK_a-Wert liegt, weist keine Pufferkapazität mehr auf.

Das Einstellen des pH-Wertes ist nicht so einfach, wie es auf den ersten Blick scheint. Es gibt eine Reihe von Faktoren, die die Protonenkonzentration beeinflussen und sich auf die Funktion des Puffers auswirken:

Säure/Base: Der pH-wert wird in der Regel mit NaOH/KOH bzw. HCl eingestellt. Bei langsamer Zugabe der Säure oder Lauge unter starkem Rühren wird verhindert, dass lokal eine hohe Konzentrationen an H⁺- bzw. OH^--Ionen auftritt. Andernfalls können Puffersubstanzen chemisch so verändert werden, dass sie inaktiviert werden oder in modifizierter Form hemmend wirken können. Wenn von einem Puffer die protonierte (Säure) und nichtprotonierte (Base) Form zur Verfügung stehen, kann der pH-wert auch durch Mischen der beiden Substanzen eingestellt werden. Falls monovalente Kationen stören oder untersucht werden sollen, kann der pH-wert mit Tetramethyl- oder Tetraethyl-ammonium-Hydroxid eingestellt werden. Anstelle von HCl können Acetat, Sulfat oder Glutamat verwendet werden, wobei besonders hier die Gefahr der Beeinflussung eines Enzyms besteht.

Temperatur: Der pH-wert eines Puffers kann sich je nach Puffersubstanz in Abhängigkeit der Temperatur ändern. Es empfiehlt sich daher den pH-wert möglichst bei der Temperatur einzustellen, bei der später gearbeitet werden soll. In den meisten tierischen Zellen liegt der physiologische pH-wert bei 37 °C im Bereich von pH 7,0 - 7,5. Ein besonders stark Temperatur-abhängiger Puffer ist das Tris. Eingestellt auf 7,5 bei 37 °C steigt er temperatur-abhängig im Testsystem bei 0 °C auf ca. 8,5. Good-Puffer sind generell gering Temperatur-sensitiv, Carboxylsäure-Puffer (Citrat, Format, Succinat) sogar noch weniger.

Pufferzusätze: Werden andere Komponenten zum Puffer zugegeben (z.b. EDTA, DTT, Mg²⁺), ist mit Änderungen des pH-wertes zu rechnen und er sollte nachgemessen werden.

Ionenstärke: Wie bei der Einstellung des pH-wertes, sollte auch bei der Wahl des Elektrolytes für die Einstellung der Ionenstärke der Pufferlösung (falls notwendig) vorgegangen werden, da sie in Abhängigkeit des verwendeten Elektrolyts steigt. Die Salze des Tetramethyl- bzw. Tetraethylammonium sind zum Einstellen der Ionenstärke geeignet, da die großen Kationen schlechter mit den negativen Ladungen der Enzyme interagieren können. Acetat als großes Anion interagiert seinerseits schlecht mit den Alkalimetallen.

pH-Meter-Kontrolle: Bei der Einstellung des pH-wertes eines Puffers stehen heute in der Regel akkurate pH-Meter mit digitaler Anzeige zur Verfügung. Das pH-Meter wird mit zwei pH-Standards kalibriert, die den Bereich des einzustellenden Puffers einschließen. Falls Zweifel an der Messgenauigkeit bestehen, kann dies einfach durch Standardisieren des pH-Meters mit einem 50 mm Phosphat-Puffer erfolgen, der dann 10-fach verdünnt wird. Der pH-wert sollte jetzt um 0,2 pH-einheiten höher liegen.

Nachstehend finden Sie einen Überblick über unsere PanReac AppliChem Markenprodukte, die entweder gebrauchsfertig sind oder zur Herstellung von Puffern für biowissenschaftliche Experimente und Anwendungen verwendet werden.