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El ARN y el ADN con una longitud de cadena de >150 - 200 pares de bases se desnaturalizan completamente a temperatura ambiente en formamida al 98%, pero no en urea 7 M. Esto permite determinar con exactitud el tamaño de las cadenas simples de ADN o ARN, ya que en estas condiciones la composición de las bases y la estructura secundaria no influyen en el comportamiento de la migración. El gel de poliacrilamida debe contener formamida anhidra desionizada 98%. La acrilamida y la bisacrilamida se disuelven en la formamida (1-4). El tampón de carga también contiene formamida (¡véanse los tampones de carga o “loading buffers” PanReac AppliChem!). Una técnica similar de geles de secuenciación con formamida puede utilizarse para la secuenciación de ácidos nucleicos, cuando la estructura secundaria del producto de secuenciación provoca una migración anormal, es decir, la compresión de las bandas. La inclusión de hasta un 40% de formamida es posible para superar este problema (Ref. 8, páginas 7.6.9-7.6.10 Suplemento 16). La estabilidad del ARN es mayor en formamida que en agua tratada con DEPC. El ARN puede almacenarse durante más de un año en formamida a -20°C, en lugar de almacenarse a -70°C en agua tratada con DEPC. Además de la electroforesis en gel, la formamida desionizada se utiliza para la hibridación de ácidos nucleicos. La formamida reduce la temperatura de fusión de un híbrido ADN-ADN en una media de 0,6°C por cada 1% de formamida; la concentración máxima es del 50%. Al añadir formamida, la temperatura durante el proceso de hibridación puede reducirse en comparación con una solución acuosa. A temperaturas más bajas se desprende menos ADN de la membrana de nitrocelulosa. Además, se reducirá la hibridación de fondo de las sondas de ARN heterólogas. En combinación con membranas de nylon, no se observó ninguna ventaja importante. Una solución típica de prehibridación/hibridación con formamida puede estar compuesta por: SSC 5X, solución Denhardt 5X, formamida al 50 % (p/v), SDS al 1 % (p/v) y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado añadido justo antes de su uso (ref. 8, p. 2.10.7 Suplemento 35). El uso de tampones que contienen formamida aumenta la hibridación específica en los experimentos de blotting y reduce así el número de pasos de lavado. Esto debe tenerse en cuenta si se cambia a tampones sin formamida (6).
Literature
(1) Pinder, J.C. et al. (1974) Biochemistry 13, 5367-5373. Propiedades del ARN en formamida. (2) Pinder, J.C. et al. (1974) Biochemistry 13, 5373-5378. Electroforesis de ARN en formamida. (3) Maniatis, T. & Efstratiadis, A (1980) Methods Enzymol. 65, 299-305. Fraccionamiento de ADN o ARN de bajo peso molecular en geles de poliacrilamida con formamida al 98% o urea 7 M (4) Meinkoth, J. & Wahl. G. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284. Hibridación de ácidos nucleicos inmovilizados en membranas. (5) Chomczynski, P. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 3791-3792. El almacenamiento de ARN en formamida aumenta la estabilidad del ARN. (6) Cornish, E.C. et al. (1998) BioTechniques 25, 948-954. Mejora del método Southern blot: Influencia del tampón de hibridación. (7) Kafatos, F.C. et al. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552. Determinación de homologías de secuencias de ácidos nucleicos con "hibridación por puntos". (8) Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) 2001. Currrent Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, N.Y.
