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La alta afinidad de los iones de níquel por la histidina es muy adecuada para la purificación de proteínas recombinantes, que se fusionan con la denominada "His-tag" (normalmente 6 residuos de histidina en el extremo N o C de la proteína a purificar). Esta proteína modificada puede expresarse en células infectadas con vaccinia (3), bacterias (4), levaduras o células de insectos (5) y purificarse mediante columnas de níquel-NTA. La proteína unida puede eluirse con imidazol, que compite con los residuos de histidina de la proteína por los iones de níquel. La concentración óptima de imidazol varía en función de la proteína, pero suele oscilar entre 40 y 200 mM. El imidazol también se utiliza habitualmente como sustancia tampón para las reacciones enzimáticas. La concentración de trabajo oscila, por ejemplo, entre 20 mM (2) y 50 mM (5), pero también puede llegar a 100 mM (6). Una concentración de 1 M reduce la temperatura de fusión del ADN en aproximadamente 13°C y cambia la movilidad en la electroforesis en gel (7). Nota: El DEPC reacciona con la forma no protonada del imidazol (1) y se formará N-carbetoximidazol. El DEPC se hidroliza, por lo que puede ser necesario determinar la concentración exacta. Esto puede hacerse mediante mediciones espectrofotométricas tras la incubación con 10 mM de imidazol a 230 nm (pH 7,5). Estabilidad: Las soluciones de imidazol son estables durante varios años (al menos 6 años). No es necesario autoclavar las soluciones ni almacenarlas protegida de la luz. Los tampones que contienen imidazol se vuelven amarillos con el tiempo. Estas soluciones siguen siendo adecuadas para eluir proteínas His-tag.
Literature
(1) Miles, E.W. (1977) Methods Enzymol. 47, 431-442. Modificación de los residuos de histidilo en las proteínas por medio del dietilpirocarbonato. (2) Storrie, B. & Madden, E.A. (1990) Methods Enzymol. 182, 203-225. Aislamiento de orgánulos subcelulares. (3) Janknecht, R. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976. Purificación rápida y eficaz de la proteína nativa marcada con histidina expresada por el virus vaccinia recombinante. (4) Ohkuma, Y. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 4856-4866. Análisis del papel de TFIIE en la transcripción basal y la fosforilación del dominio carboxi-terminal mediada por TFIIH mediante estudios de estructura-función de TFIIE-α. (5) Marrakchi, N. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1244, 147-156. Cerastocitina, un nuevo activador plaquetario similar a la trombina procedente del veneno de la víbora tunecina Cerastes cerastes. (6) Tavenier, M. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1244, 351-356. Cinética del metabolismo del adenilato en el miocardio humano y de rata. (7) Eli, P. et al. (1999) J. Biochem. 125, 790-794. Desnaturalización del ADN con imidazol.
