Comments
El DAPI es un excelente colorante para la tinción del ADN. Originalmente, sólo se conocía la unión específica a pares de bases AT sin intercalación de DAPI (2), pero posteriormente se demostró la intercalación en pares de bases GC (3). La aplicación más popular del DAPI es su uso como reactivo para detectar ADN de micoplasma o virus (por ejemplo, infección por vaccinia o contaminación viral "no deseada") en el cultivo celular. Se recomienda el siguiente método de tinción: cultivar las células sobre un cubreobjetos en placa de cultivo celular hasta alcanzar aproximadamente el 70 % de confluencia. Retirar el medio de las células. Lavar el cubreobjetos una vez con 1 μg/ml de DAPI en metanol. Incubar las células en el cubreobjetos a 37°C durante 15 minutos en 1 μg DAPI/ml en metanol. Retirar la solución de tinción y lavar el cubreobjetos una vez con metanol. Colocarlo boca abajo en un portaobjetos con PBS o glicerol como medio de montaje. No utilizar agua. Examinar las células al microscopio (excitación: 365 nm; emisión máxima a 450 nm). La incubación prolongada con DAPI aumenta la fluorescencia nuclear, un tiempo de incubación más corto conduce a una tinción nuclear más débil, lo que facilita la observación de la fluorescencia citoplasmática. Solubilidad / Estabilidad: El DAPI se disuelve en agua, ya que es insoluble en PBS. La solubilidad es de aproximadamente 25 mg/ml. Las soluciones madre suelen prepararse con una concentración de 1 a 5 mg/ml. Las soluciones de trabajo se obtienen por dilución con metanol. Los tampones no deben utilizarse para la dilución. Diluir la solución madre con metanol hasta una concentración final de 1 μg/ml. . Las soluciones son estables durante 1 a 2 semanas a temperatura ambiente (4), hasta 6 meses a +4°C y entre 6 y 12 meses si se congelan (alícuotas de 1 ml). La turbidez de la solución es un signo de hidrólisis. La DAPI se decolora rápidamente en contacto con la luz, aunque es relativamente estable en la luz ultravioleta. Por lo tanto, las incubaciones deben realizarse protegidas de la luz. Si las preparaciones se almacenan durante un día a +4°C, la fluorescencia se estabiliza.
Literature
(1) Russel, W.C. et al. (1975) Nature 253, 461-462. Una técnica citoquímica sencilla para la demostración del ADN en células infectadas con micoplasmas y virus. (2) Kapuscinski, J. & Szer, W. (1979) Nucleic Acids Res. 6, 3519-3534. Interacción de la 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) con polinucleótidos sintéticos. (3) Wilson, W.D. et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111, 5008-5010. Intercalación de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en GC y secuencias mixtas de ADN: Intercalación de una molécula clásica de unión al surco. (4) Otto, F. (1990) Methods Cell Biol. 33, 105-110. Tinción con DAPI de células fijadas para la "citometría de flujo". (5) Schweizer, D. (1976) Chromosoma 58, 307-324. Bandeo cromosómico fluorescente inverso con cromomicina y DAPI. (6) Naimski, P. et al. (1980) Anal. Biochem. 106, 471-475. Análisis cuantitativo por fluorescencia de diferentes conformaciones del ADN unido a DAPI. (7) Daxhelet, G.A. et al. (1989) Anal. Biochem. 179, 401-403. Espectrofluorometría de colorantes con ADN de diferente composición y conformación de bases. (8) Xia, H. et al. (1997) BioTechniques 22, 934-936. Detección de infecciones por micoplasma en células de mamíferos.
