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El azul brillante Coomassie® R-250 es una de los colorantes más utilizados para las proteínas, tras su separación por electroforesis en gel de poliacrilamida. El complejo proteína-colorante tiene un máximo de absorción a 549 nm, el colorante sin proteína a 555 nm (en tampón citrato 0,01 M, pH 3). La intensidad en la tinción de las proteínas depende probablemente de la basicidad de una proteína (5). Por cada aminoácido cargado positivamente se unen aproximadamente 1,5 - 3 moléculas de Coomassie®. Esta variación complica la determinación exacta de la proteína con la albúmina como estándar, ya que esta proteína contiene más aminoácidos básicos que muchas otras proteínas (5). Existen muchos protocolos de tinción sensible con Coomassie® (por ejemplo, ref. 3, 4). La sensibilidad llega hasta 25 ng de proteína. (4). Recomendamos el siguiente protocolo: I. Solución de tinción: Azul Brillante Coomassie® R-250 (A1092) 0,1 %, metanol (o etanol) 20 % (o etanol), ácido acético 10 %. El gel SDS (sin gel concentrador o “stacking gel”) se tiñe durante 1 hora a 60°C o durante 2 horas a 50°C o durante la noche a temperatura ambiente. II. Solución decolorante: metanol (o etanol) 20 %, ácido acético 10 %. Decolorar el gel durante 3 - 4 horas a 50 - 60°C. Posteriormente lavar el gel durante 15 minutos en agua y secar al vacío a 60°C durante 2 - 3 horas.
Literature
(1) Fazekas De St. Groth, S. et al. (1963) Biochim. Biophys. Acta 71, 377-391. Dos nuevos procedimientos de tinción para la estimación cuantitativa de proteínas en tiras de electroforesis. (2) Chrambach, A. et al. (1967) Anal. Biochem. 20, 150-154. Un procedimiento para la tinción rápida y sensible de proteínas fraccionadas por electroforesis en gel de poliacrilamida. (3) Neuhoff, V. et al. (1988) Electrophoresis 9, 255-262. Mejora de la tinción de proteínas en geles de poliacrilamida, incluyendo geles de enfoque isoeléctrico con un fondo claro a una sensibilidad de nanogramos utilizando Coomassie® Briliant Blue G-250 y R-250. (4) Choi, J.-K. et al. (1996) Anal. Biochem. 236, 82-84. Tinción con azul Coomassie® modificado de proteínas en geles de poliacrilamida con marrón Bismark. (5) Tal, M. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 9976-9980. ¿Por qué el Azul Brillante R de Coomassie® interactúa de forma diferente con distintas proteínas?
