Comments
El ONPG es uno de los principales sustratos en los ensayos de la enzima β-galactosidasa. Las propiedades de esta enzima se han estudiado en detalle (por ejemplo, ref. 1-3). Los plásmidos de expresión con la secuencia codificante de la β-galactosidasa se utilizan ampliamente como controles internos en los experimentos de transfección en los estudios de expresión y transcripción, generalmente bajo el control de un potenciador fuerte (SV40, CMV, RSV, VIH, etc.). La actividad de la enzima se determina fácilmente a partir de extractos celulares (por ejemplo, ref. 4). La escisión de ONPG libera el colorante amarillo 4-nitrofenilo y la absorción se mide a 405 - 420 nm por espectrofotometría. Un tampón de reacción comúnmente utilizado es: Na₂HPO₄ 60 mM / NaH₂PO₄ 39 mM, pH 7,0 / KCl 10 mM / MgSO₄ 1 mM / DTT 2 mM y 1 mg/ml de ONPG. El ONPG es de baja solubilidad. El ONPG sólido se añade al tampón de reacción y se disuelve calentando el tampón a 37°C y/o mezclando bien. El DTT se añade fresco (al igual que el ONPG) a partir de una solución madre de 1 M (4). Nota: Para las investigaciones mencionadas anteriormente, se utiliza la β-galactosidasa bacteriana (E. coli). El pH óptimo de esta enzima es de 7,3. En las células de mamíferos existe una β-galactosidasa lisosomal con un pH óptimo de 3,5. Asegúrese de que el pH del tampón de reacción es correcto, de lo contrario podría haber un ruido de fondo significativo por la enzima endógena.
Literature
(1) Wallenfels, K. et al. (1960) Biochem. Z. 333, 377-394. Estudios sobre las enzimas que dividen la lactosa. (2) Wallenfels, K. (1962) Methods Enzymol. 5, 212-219. β-Galactosidasa: Métodos de ensayo. (3) Levvy, G.A. & Conchie, J. (1966) Methods Enzymol. 8, 571-584. Glucosidasas de mamíferos y su inhibición por aldonolactonas. (4) Janknecht, R. et al. (1995) Oncogene 10, 1209-1216. SAP1a es una diana nuclear de las cascadas de señalización que implican a las ERK.
