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Es gibt zwei wichtige Anwendungen für den SSC - Puffer. Er wird zur Denaturierung von DNA beim Screening von DNA-Bibliotheken (z.B. genomische DNA, cDNA, YAC) eingesetzt. Die Sonde kann nur an die DNA der Bibliothek binden, wenn diese einzelsträngig vorliegt. Die Arbeitskonzentration liegt hierfür bei 2X (Ref. 4, z.B. S. 6.1.3).Die zweite wichtige Anwendung findet SSC-Puffer als Transfer-Puffer beim Blotten von DNA nach der Gelelektrophorese aus Agarose- oder Polacrylamid-Gelen auf Nitrocellulose oder Nylon-Membranen (Southern-Blot). Bei Verwendung von Nitrocellulose-Membranen sollte mit 20X SSC eine sehr hohe Konzentration (hohe Ionenstärke) eingesetzt werden, da bei niedrigeren Konzentrationen (z. B. 10X) kleinere DNA-Fragmente verloren gehen können. Für Nylon-Membranen sind 20X und 10X SSC-Puffer gut geeignet, je nach Nylon-Membran können aber mit anderen Bedingungen (bei positiv geladenen Membranen z. B. ein alkalischer Transferpuffer) bessere Ergebnisse erzielt werden.Bei Verwendung als Transferpuffer muß SSC-Puffer nicht filtriert werden, für die Hybridisierungslösung muß SSC-Puffer filtriert sein. SSC-Puffer von AppliChem wird grundsätzlich filtriert. SSC-Puffer kann in der jeweils gleichen Konzentration durch SSPE-Puffer (A1397) ersetzt werden. SSPE besitzt eine höhere Pufferkapazität als SSC. Die Pufferkapazität von SSC kann aber einfach durch Zugabe von 0,3 % (w/v) Natriumpyrophosphat erhöht werden.In den Referenzen 3 und 4 werden die verschiedenen Techniken detailiert beschrieben: Ref. 3:Southern Blotting (S. 6.41-6.58) Northern-Hybridisierung (S. 7.36-7.44) Screening von rekombinanten DNA-Bibliotheken (S. 1.98-1.104, 8.46-8.52) Dot und Slot-Hybridisierung (S. 7.48-7.50) Ref. 4:Southern Blotting (S. 2.9.1-2.9.15 Supplement 21) Dot und Slot Blotting (S. 2.9.15-2.9.20 Supplement 21) Hybridisierungsanalyse des DNA-Blots (S. 2.10.1-2.10.16 Supplement 21) Screening von rekombinanten DNA-Bibliotheken (Kapitel 6; Hybridisierung mit radioaktiven Proben S. 6.3.1-6.3.6; Verwendung synthetischer Oligonukleotide als Proben S. 6.4.1-6.4.3 Supplement 13)
Literature
(1) Southern, E.M. (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517. Detektion spezifischer Sequenzen von DNA-Fragmenten nach der Gelelektrophorese. (2) Chomczynski, P. (1992) Anal. Biochem. 201, 134-139. Alkalischer Kapillartransfer für Blotten von DNA und RNA. (3) Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Seite A1.14. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. (4) Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995) Current Protocols in Molecular Biology. Seite A.2.5 (Suppl. 40) Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York. (5) Nagamine, Y. et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8, 2453-2460. Selektives Blotten von DNA-Restriktionsfragmenten auf Nitrocellulose bei niedrigen Salzkonzentrationen.
