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Coomassie® Brillantblau R-250 ist einer der am weitesten verbreiteten Farbstoffe für Proteine nach Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Der Protein-Farb-Komplex hat ein Absorptionsmaximum bei 549 nm, der Farbstoff allein bei 555 nm (in 0,01 M Citratpuffer, pH 3). Die Färbeintensität hängt wahrscheinlich mit der Basizität eines Proteines zusammen (5). Pro positive Ladung werden ca. 1,5 - 3 Moleküle Coomassie® gebunden. Diese Schwankungen erschweren exakte Proteinbestimmungen mit Albumin als Standard, da dieses Protein mehr basische Aminosäuren erhält als viele andere Proteine (5). Es gibt viele Protokolle für sensitive Färbungen mit Coomassie® (z. B. Ref. 3, 4). Die Sensitivität reicht dabei bis auf 25 ng Protein (4). Wir empfehlen folgendes Protokoll:I. Färbelösung: 0,1 % Coomassie® Brillantblau R-250 (Art.-Nr. A1092)20 % Methanol (oder Ethanol)10 % EssigsäureDas SDS-Gel (ohne 'stacking gel') wird für 1 Std. bei 60°C gefärbt oder für 2 Std. bei 50°C oder über Nacht bei RT.II. Entfärbelösung: 20 % Methanol (oder Ethanol)10 % EssigsäureDas Gel wird für 3 - 4 Stunden bei 50 - 60°C entfärbt. Es sollten Schwämme zugefügt werden.Im Anschluß daran wird das Gel für 15 Minuten in Wasser gewaschen und dann unter Vakuum bei 60°C für 2 - 3 Stunden getrocknet.
Literature
(1) Fazekas De St. Groth, S. et al. (1963) Biochim. Biophys. Acta 71, 377-391. Erstmalige Verwendung von Coomassie® Brillant Blue R250 für die quantitative Bestimmung von Proteinen nach Elektrophorese. (2) Chrambach, A. et al. (1967) Anal. Biochem. 20, 150-154. Verbessertes Protokoll der Färbung von Proteinen im Polyacrylamidgel. (3) Neuhoff, V. et al. (1988) Electrophoresis 9, 255-262. Weitere Verbesserung der Färbung von Proteinen im Polyacrylamidgel auch nach IEF. (4) Choi, J.-K. et al. (1996) Anal. Biochem. 236, 82-84. Modifizierte Coomassie® Blau-Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen mit Bismark Brown. (5) Tal, M. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 9976-9980. Warum interagiert Coomassie® Brillant Blau R unterschiedlich mit unterschiedlichen Proteinen?
