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DAPI ist ein hervorragender Farbstoff für die Färbung von DNA. Ursprünglich war nur die spezifische Bindung an AT-Basenpaare ohne Interkalation von DAPI bekannt (2), später wurde aber auch die Interkalation in GC-Basenpaare nachgewiesen (3). Praktische Bedeutung hat DAPI z.B. als Nachweisreagenz von Mycoplasmen- oder Virus-DNA in der Zellkultur. Die folgende Färbemethode wird empfohlen: Zellen, die auf einem Deckglas in der Kulturschale gewachsen sind, werden einmal mit DAPI/Methanol (1 μg/ml) gewaschen und dann bei 37°C für 15 Minuten mit 1 μg DAPI/ml Methanol inkubiert. Danach wird das Deckglas mit Methanol gewaschen und umgedreht auf einen Objektträger gelegt. Das Präparat wird mit Licht der Wellenlänge 365 nm (Absorptionsmax. bei 340 nm; Emissionsmax. bei 450 nm) beobachtet. Es empfiehlt sich die Zellen nur bis zu einer Konfluenz von ca. 70 % wachsen zu lassen, da andernfalls Mycoplasmen schwerer zu erkennen sind. Bei längerer Inkubation mit DAPI erhöht sich die Kernfluoreszenz, bei kürzerer Inkubation fällt die Kernfärbung schwächer aus und die Beobachtung der cytoplasmatischen Fluoreszenz ist erleichtert. Der Nachweis von Vaccinia-Infektionen ist z.B. auch möglich.Löslichkeit / Stabilität: DAPI wird in Wasser gelöst, da es in PBS unlöslich ist. Die Löslichkeit beträgt ca. 25 mg/ml. Stammlösungen werden üblicherweiser mit einer Konzentration von 1 - 5 mg/ml hergestellt. Arbeitslösungen erhält man durch Verdünnung mit Methanol (z. B. 1:1000). Es sollen keine Puffer zur Verdünnung verwendet werden! Die Lösungen sind bei Raumtemperatur 1 - 2 Wochen stabil (4), bei +4°C bis zu 6 Monaten und im eingefrorenen Zustand zwischen 6 und 12 Monaten (1 ml Aliquots). Eine Trübung der Lösung ist ein Zeichen für Hydrolyse. DAPI bleicht bei Lichtkontakt schnell aus, auch wenn es in UV-Licht relativ stabil ist. Inkubationen sollten daher lichtgeschützt durchgeführt werden. Wenn Präparate einen Tag bei +4°C gelagert werden, wird die Fluoreszenz etwas stabilisiert.
Literature
(1) Russel, W.C. et al. (1975) Nature 253, 461-462. Einfache Technik zum Nachweis von DNA in Mycoplasmen- oder Virus-infizierten Zellen. (2) Kapuscinski, J. & Szer, W. (1979) Nucleic Acids Res. 6, 3519-3534. Interaktion von DAPI mit synthetischen Polynukleotiden. (3) Wilson, W.D. et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111, 5008-5010. Interkalation von DAPI in GC- und gemischte Sequenzen der DNA. (4) Otto, F. (1990) Methods Cell Biol. 33, 105-110. DAPI-Färbung von fixierten Zellen für die 'flow cytometry'. (5) Schweizer, D. (1976) Chromosoma 58, 307-324. 'Reverse Fluorescent Chromosome Banding' mit Chromomycin und DAPI. (6) Naimski, P. et al. (1980) Anal. Biochem. 106, 471-475. Quantitative Fluoreszenzanalyse verschiedener Konformationen von DAPI-gebundener DNA. (7) Daxhelet, G.A. et al. (1989) Anal. Biochem. 179, 401-403. Spectrofluorometry of Dyes with DNAs of Different Base Composition and Conformation. (8) Xia, H. et al. (1997) BioTechniques 22, 934-936. Nachweis von Mycoplasma-Infektionen von Säugerzellen.
